カンカニクジュヨウ中のフェニルエタノイド配糖体がアミロイドβ蛋白誘導のPC12細胞の損傷に対する保護作用

 カンカから分離されたフェニルエタノイド配糖体のAβ25-35誘導のPC12細胞の損傷に対する保護作用を観察し, そして, 定量構造活性相関を分析して, より効果的な神経保護薬物の発見を研究した.

 1北京大学 中医薬現代研究所,
○屠 鵬飛1, 劉 曉明1

アルツハイマー病(Alzheimers disease:AD)は, 老年神経系統の退行性疾患(Degenerative Disease)の一種であり, その神経薬理学の特徴が脳中の神経元線維変化(Neurofibrillary Tangles:NFTs), 老人斑の出現, 神経元とシナプス(Synapse)の失いなど.老人斑の主な成分はアミロイドβ蛋白(Amyloid beta-protein:Aβ)で, アミロイドβ蛋白の前駆体蛋白(Amyloid Precursor Protein:APP)の分裂による生じた毒性蛋白である.Aβは多種のルートを通して, 神経元に毒性作用を生成でき, AD発病機能の中に重要な役目を果たしている.

カンカニクジュヨウは伝統的な腎臓への強壮剤の一種類であり, 民間では常にCistanehe. sinensis G.Beckを代用品として使用されている.以前沢山の研究で「カンカニクジュヨウの中のフェニルエタノイド配糖体及び部分のフェニルエタノイド配糖体の単体化合物(例えば, ツブロシドB-Tubuloside Bとエキナコシド-Echinacoside)が神経細胞への保護作用がある」を発見したが, カンカニクジュヨウ中のほかのフェニルエタノイド配糖体はすべて活性があるかどうか, いままでまだこの方面の情報が得られなかった.その為, 我々はカンカニクジュヨウとC.sinensis G.Beckを分離し, 純化し, MTT検査法を利用して, 「カンカニクジュヨウから分離されたフェニルエタノイド配糖体(Phenylethanoid Glycosides:PhGS)がAβ2535誘導のPC12細胞(Cell line PC12 that has been successfully used over the years to study neuronal function1112)の損傷に対する保護作用」を観察し, そして, 定量構造活性相関(Quantitative Structure-Activity Relationship:QSAR)を分析して, より効果的な神経保護薬物の発見を研究した.

我々はカンカニクジュヨウのN-ブタノール(N-Butanol)の層中から15個のフェニルエタノイド配糖体を分離, 各種のスペクトルと波動スペクトル方法で鑑定した.その中で化合物5は一種の新しい化合物であり, Cistanehe. sinensis G.Beck Bと命名された.ほかの化合物はツブロシドB3, アクテオシド3(Acteoside), Poliumoside4, エキナコシド3, ツブロシドE5, Campneoside II(S/R)6, 2’-O-acetylacteoside3, Salsaside E7, Plantainoside C8, Cistanoside C9, 2’-O-acetylpoliumoside4, Osmanthuside B6(Z/E)10

材料と方法

1640培養基, トリプシン(Trypsin)-EDTA -(Gibico社から);
ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum:FBS), ウマ血清(Horse Serum)-(Hyclone社から);
MTT, Aβ2535 -(Sigma社から);
PMSF -(Genview社から);
クルクミン(Curcumin)-(中国北京市薬検所から);
PC12 Cell Strain -(中国医学科学院薬物所から).

結果

浅い黄色の無定形粉末, TLCで5%のFeCl3条件下, 藍ねず色を表した0, UV365で藍色の蛍光を発し, フェノール(Ph-OH)と共役系統(Conjugated systemの存在を表示している.ESI-MSから擬分子イオン峰の信号826[M-H]が分かった.1HNMRスペクトルと13CNMRスペクトルのデータを参考にし, 化合物の分子式がC38H50O20に推測できる.

1HNMRスペクトルから2組の明らかなAMX系統的なベンゼン環水素の信号δ6.57 (1H, dd, J=8.0Hz, 2.0Hz), 6.62 (1H, d, J=1.5Hz), 6.81 (1H, d, J=8.5Hz), 6.75 (1H, d, J=8.0Hz), 6.98 (1H, br.d, J=8.0Hz)と7.03 (1H, br.s)が分かった.また, d6.21 (1H, d, J=15.5Hz)と7.50 (1H, d, J=16.0Hz)はPhenyl-propenoyl Trans-alkeneの二つの信号であるので, 13CNMRスペクトル中のδ110-160間の14個のアルケンC(Alkene)信号を参考にし, 更に以上の推測を証明できる.

水素スペクトルδ2.65 (2H, m)と炭素スペクトルδ 34.6はPhGSのアグリコン( Aglycon) β位メチレン(Methylene)の特徴信号であり, この化合物は一つのPhGS化合物であることを証明した.

δH: 3.72 (3H, s)とδC: 55.7は一つのメトキシ基(Methoxy Group)があることを示した.HMBCスペクトルの中(Fig 3-2)にメトキシ基水素はδ146.1或いは146.0の炭素信号と長距離の関連があり, 距離が近過ぎで識別しにくい.またこの二つの水素信号はアグリコン中のH-2, H-5, H-6と長距離の関連があるので, メトキシ基はアグリコンの3位或いは4位で代わられたことを推測できる.さらに, NOESYスペクトルより, メトキシ基の水素信号はアグリコンの5位水素と明らかなNOE効能反応があり, しかし2位水素と空間関連性がないことから, メトキシ基の取って代わりがアグリコンの4位に発生することを説明できた.

NMRスペクトルの中にδH: 1.98 (3H, s) 及びδC: 20.5, 169.1の信号があるので, アセチル基(Acetyl Group)の存在を証明した.

13CNMRスペクトルの中にδ102.0, 100.5, 99.2が3個の糖端基(End Group)炭素の信号であり, 水素スペクトルの中も3個の糖端基水素の信号δ4.49 (1H, br.d), 4.61 (1H, br.d) と4.64 (1H, d, J=8.5Hz)が現れた.水素スペクトルの中δ0.93 (3H,d,J=6.0Hz) , 1.05 (3H ,d, J=6.5Hz)及びδC: 17.7, 18.1から, 一つのβ-D-ブドウ糖と二つのα-L-Rhamnosylの存在を推測した.この化合物は一つのPhGS Triglycosides化合物である.化合物S-23は既存化合物S-12の13CNMRスペクトルベータと比較して, 両者はアグリコンのベンゼン環のところに小さな差がある以外に, その他の部分は大体同じであることから, RhaとRha’が其々にGlcの3位と6位と繋げていることを示した.更に, HMBCスペクトルの中で, δH: 4.49 (1H, br.d, R’-1) , δC: 65.5 (G-6) とδH: 4.61 (1H, br.d, R-1) , δC: 77.9 (G-3)の長距離の関連関係からも上記の推測を証明した.

二次元スペクトルの情報及び関連文献を結合し, 当化合物その他の帰属を研究した.最終的に確定した当化合物の結構は2-(3-ヒドロキシ-4-メトキシ基フェニル) ethide-O-α-L- pyrans rhamnosyl -(1→3)-[ αL- pyrans rhamnosyl -(1→6)]-(4-O-E- caffeoyl)-2-O-アセチル基-β-D- pyransグルコシド[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamn-opyranosyl-(1→6)]-(4-O-E-caffeoyl)-2-O-acety1-β-D-glucopyranoside]である.検索より, 一つの新しい化合物であるので, Cistansinenside Bと名づけられた.

1.形態学観察

倒立型顕微鏡で観察すると, 損傷グループの細胞数が顕著に減り, 陽性対照グループと正常対照グループの細胞数が明らかに増えた.保護グループの細胞数は損傷グループと比べて多くなった.

2.MTT実験の結果

選別薬物の数量が比較的に多いので, いくつかの96孔培養板を選び, 平行培養する.各培養板間の絶対光吸収値にある程度の差がある.薬物活性を比較するために, 各培養板の中の正常対照グループの細胞の光吸収度の平均値を100%に設定し, ほかの各グループの細胞の光吸収値はそれと比べ, 対応の百分比率の値を計算する.
各グループ細胞のMTT光吸収度比率の値は図表6-3をご参考ください.

図表6-3  化合物が神経細胞の生長に対する影響(MTT法で測定)

グループ

濃度(mol/L)

MTT(%)

正常対照グループ 100±9.6
損傷グループ 50.2±11.2
陽性対照グループ(Curcumin) 1 76.1±7.3**
保護グループ
1. ツブロシドB 0.01 68.3±11.8*
0.1 79.7±10.1**
1 98.7±12.9**
2. アクテオシド 0.01 75.2±6.9**
0.1 77.7±9.5**
1 80.7±10.6**
3. Poliumoside 0.01 71.4±9.7*
0.1 78.2±6.7**
1 87.0±18.6**
4. エキナコシド 0.01 70.7±10.3*
0.1 68.8±8.2*
1 73.9±10.8*
5. Cistansinenside B 0.01 68.4±5.9**
0.1 73.0±6.7**
1 76.2±10.1**
6. ツブロシドE 0.01 67.9±17.2
0.1 81.4±17.1*
1 71.4±12.9*
7. Campneoside II(S/R) 0.01 62.5±13.3
0.1 64.5±9.1*
1 94.2±19.6**
8. 2’-O-acetylacteoside 0.01 77.8±13.2*
0.1 72.9±14.1*
1 83.5±16.8**
9. 2’-O-acetylcistanoside C 0.01 82.9±13.4**
0.1 74.6±14.7*
1 94.8±14.9**
10. Plantainoside C 0.01 72.5±13.2*
0.1 77.3±11.8**
1 81.4±7.9**
11. Cistanoside C 0.01 68.0±10.4*
0.1 66.9±11.5*
1 79.5±9.8**
12. 2’-O-acetylpoliumoside 0.01 77.9±9.8**
0.1 80.6±13.1**
1 90.3±17.3**
13. Osmanthuside B6 (Z/E) 0.01 61.8±9.9
0.1 66.9±12.3
1 80.1±10.4**

3.細胞毒性実験

細胞毒性実験結果は表4をご参考ください.表6-4から, 個別の化合物は高濃度の時細胞に多少損傷を与える以外に, その他の化合物は濃度が100μmol/Lになった時でも, 細胞毒性はない.

Discussion
ニクジュヨウ属植物中のPhGS(Compoud 1-13)

当類化合物は全部若干違う程度の神経細胞保護活性を表わし, カンカニクジュヨウ神経保護作用の主要な活性成分として, 今後ADの予防と治療で更に研究する必要がある.一部の化合物は濃度が高い時, より高い活性を表わしており, しかも多数の化合物は明らかに剤量との反応関係を表わした.薬物濃度の増加とともに, 神経保護活性も強くなる.

(1)アグリコンは活性への影響

実験の結果として, アグリコンの変化は化合物の活性に顕著な影響はないことが分かった.化合物5と10はアグリコン部分の構造だけが異なり, 5アグリコン部分は3-ヒドロキシ-4-メトキシに代わられ, 10は3,4-ジヒドロキシに代わられ, 活性結果として10は5より少し強い;化合物9アグリコンは3-メトキシ-4-ヒドロキシに代わられ, 8は3,4-ジヒドロキシに代わられ, その他の部分の構造は同じである.両者の活性を比べると, 9は8より少し強い;また化合物11と化合物2の状況はこれと似ているが, 活性の結果は2が11より少し強い.上記活性の強弱を集計した結果として顕著な相違がないため, アグリコン部分の変化は活性に顕著な影響はないことを証明した.またカンカニクジュヨウ尿代謝物中フェニル酢酸(Phenylacetic Acid)化合物(29,30)に神経保護活性を表わさなかったことから, PhGSアグリコン部分はカンカニクジュヨウ神経保護作用の活性原子団(Reactive Group)ではないことを推測した.

(2)エステル基は活性への影響

活性実験の結果はPhGS中のエステル基は神経細胞保護作用の活性原子団であることを証明した.

A.エステル基中代わる原子団の変化は活性への影響が大きい

化合物6と13エステル基部分は4位ヒドロキシに代わられ, 二つ共に一定の神経細胞保護活性を表わした, またエステル基の3位はヒドロキシに代わられた後(化合物8及び1), 神経細胞保護活性は強くなった;当化合物2(3,4-ジヒドロキシに代わられた)エステル基3位はメトキシに代わられた後(化合物10), 活性には明らかな変化がない.上記の結果はエステル基3,4位ヒドロキシは神経保護活性に影響があり, その内4位ヒドロキシの影響はもっと顕著である.
上記の結論は尿中の代謝物PM-1~PM-7の活性結果からも認証された.化合物PM-1~PM-7母核は全部肉桂アシル基(Acyl)で, 構造はPhGSのエステル基と同じである.肉桂アシル基4位はヒドロキシ(PM-5)に代わられた後, 一定の神経細胞保護活性を表わした;若し4位はメトキシ(PM-6)に代わられ, 活性が弱くなる;若し4位はメチル基(Methyl PM-4)に代わられ, 結果として活性が表わさない.上記の結果は肉桂アシル基4位ヒドロキシより代わられることは神経細胞保護活性への影響は比較的に大きいことを証明した.

当化合物PM-5の3位ヒドロキシ基は再びヒドロキシ基(PM-3)に代わられた後, 活性は明らかに強くなった;若し3位はメトキシ基(PM-2)に代わられ, 活性はPM-3との差は明らかではない;肉桂アシル基の3,4位あるいは2,3位は全部メトキシ基に代わられた後(PM-7とPM-8), 神経細胞保護活性はない.
上記の実験結果は肉桂アシル基の3位ヒドロキシ基は代わられることより神経保護活性には一定の影響があるけれども, 4位ヒドロキシ基の方は影響が大きいことを示した.

B. エステル基と糖の繋げる位置は活性への影響

PhGS中のエステル基はglcの6位に繋げたとき(化合物1), 活性はエステル基がglcの3位(化合物8)に繋げたときより強い.多分6位がエステル基と繋げた時化合物と受体結合の抵抗力は小さいことが原因である.

(1)糖は活性への影響

化合物1-13の中化合物3, 4, 5, 12はTriglycosidesであり, その他の化合物は全部Diglucosideである.ところが, 実験結果から両者に活性が明らかな相違があることを見つけられなかった.しかもカンカニクジュヨウ尿代謝物中に一部糖鎖を含んでいない代謝物からもよい活性が現しているため, 糖鎖の長さはカンカニクジュヨウ神経細胞保護活性への影響は大きくないことを推測した.

Aβは一種の相対分子量が4.2X103のポリペプチド(Polypeptide)であり, 39~42個のアミノ酸を含み, 沢山正常細胞中のAPPの裂解産物である.沢山の研究者は下記のように認めている:Aβ繊維を凝集形成する過程でAβの集まりは神経細胞に毒性作用を現しており, AD病と関連している神経元変性を引き起こしのキーポイントである.凝集する速度は速いほど, 細胞への毒性も大きくなる.可能性としてAβ繊維を形成するプロセスでROSを神経元中で集まらせ, 酸化ストレス(Oxidative Stress)とCaイオン平衡を破壊する.
一部の体外実験からPhGSは遊離基を除去, 抗酸化, 神経保護などの効果があることが証明され;更に沢山の体内実験はカンカニクジュヨウ抽出物及びPhGSはラットの学習記憶力を改善させるなどの効果があることも証明された.ところが, カンカニクジュヨウのPhGS化合物は抗AD脳作用はあるかどうかはまだ定論されていない.当実験はAβ25‐35を利用し, 誘導体外培養したPC12細胞損傷を処理する.顕微鏡で細胞の数量と形態の変化を観察し, MTT法でPhGSは損傷細胞への作用を検査した結果, 保護組の細胞数量は明らかに損傷組より多い, MTT値も顕著に損傷組より高いである.実験はAβが細胞を誘導損傷させた時, 恐らく細胞膜蛋白質糖化, 交聯及び脂質過酸化を通じて, 細胞膜と糸粒体膜の通透性を破壊し, 大量な細胞を損傷死亡させたを示した.PhGSはAβ誘導の細胞毒性を抑制作用があり, PC12細胞損傷に明らかな保護作用がある.更に, 当実験はMTT法でPhGSの細胞毒性作用を検査した結果として, PhGS自身は細胞毒性がない或いは高濃度の時少しの細胞毒性がある.
上記の研究からPhGSはAD脳の予防と治療で更に研究する可能性があることを示した.

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